清肺抑火膠囊緩解PM2.5致肺部損傷的研究報(bào)告
2016/8/5  閱讀數(shù)：

前言

大量流行病學(xué)研究標(biāo)明，大氣PM2.5污染與人體呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及癌癥等疾病的入院率、發(fā)病率、死亡率密切相關(guān)[1, 2]。呼吸系統(tǒng)疾病如肺功能降低、哮喘發(fā)作、支氣管炎癥以及肺癌都與PM2.5暴露有關(guān)[3]。目前認(rèn)為PM2.5對(duì)呼吸系統(tǒng)致病機(jī)制主要是炎性損傷和氧化應(yīng)激[4, 5]。主要表現(xiàn)為組織生化成分改變以及炎癥因子的釋放，誘發(fā)炎癥，嚴(yán)重而持久的炎癥反應(yīng)會(huì)增加肺組織的防御屏障負(fù)擔(dān)，造成惡性循環(huán)，引起組織增生纖維化，導(dǎo)致肺部疾病的發(fā)生[6]。

目前不少具有抗炎、抗氧化作用的物質(zhì)引入干預(yù)PM2.5損傷的研究，如大黃素、維生素E、番茄紅素、黑巧克力、人參皂苷Rg[7-10]等。清肺抑火膠囊處方來源于明龔延賢《壽世保元》，屬中醫(yī)經(jīng)典處方之一，由黃芩、梔子、天花粉、桔梗、知母、大黃、前胡、黃柏、苦參組成。具有清肺止咳，降火生津，對(duì)于呼吸系統(tǒng)疾病具有預(yù)防和治療作用。受上海方心健康科技發(fā)展股份有限公司委托，本研究以大氣PM2.5氣管滴注染毒大鼠造成的肺損傷為模型，在染毒前后分別給藥，探索清肺抑火膠囊對(duì)PM2.5染毒所致肺損傷的干預(yù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Thermo Andersen大容量采樣器，LGJ-10D型冷凍干燥機(jī)，超聲波清洗機(jī)（Ultrasonic Cleaner），IL-1β試劑盒、IL-6 試劑盒、Hs-CRP試劑盒和TNF-α試劑盒來自Ebioscience生物技術(shù)有限公司；酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒、白蛋白（albumin，ALB）試劑盒、總蛋白（total protein，TP）試劑盒均來自南京建成生物工程研究所。清肺抑火膠囊由上海中藥制藥技術(shù)有限公司提供。

1.2 PM2.5的采集及其懸液的制備

2014年4-7月，于上海市某居住區(qū)附近設(shè)置采樣點(diǎn)，其附近無工業(yè)企業(yè)，周圍人口較密集。采樣高度為16米。用Thermo Andersen 大容量采樣器采集PM2.5于玻璃纖維濾膜上。將吸附PM2.5的濾膜剪成1cm*3cm大小浸入超純水中，低溫震蕩30min*3次，洗脫P(yáng)M2.5。將洗脫的PM2.5用6層紗布過濾，濾液真空冷凍干燥，-20℃保存?zhèn)溆�。染毒前，用生理鹽水制成實(shí)驗(yàn)所需濃度的PM2.5懸液，超聲震蕩10min混勻滅菌。

1.3大鼠染毒及處理

1.3.1 SPF級(jí)SD大鼠，購自上海西普爾－畢凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，雄性，體重180-200g，合格證號(hào)：2008001641248。大鼠購入后，在SPF飼養(yǎng)室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)兩天，飼養(yǎng)溫度18-22℃，濕度為45%-55%，晝夜節(jié)律設(shè)計(jì)為12h晝夜交替。隨機(jī)分為10組，每組6只。大鼠飼養(yǎng)時(shí)間為2014.06.18到2014.07.01，共計(jì)2周。大鼠氣管滴注PM2.5懸浮液，染毒劑量為40mg/kg，隔天一次，共三次。清肺抑火膠囊每天同一時(shí)間段進(jìn)行灌胃給藥，連續(xù)給藥1周。清肺抑火膠囊用0.2%縮甲基纖維素溶解。給藥設(shè)低、中、高劑量分別為0.07g/kg·bw、0.33g/kg·bw、0.66g/kg·bw。

實(shí)驗(yàn)分組如下：

（1）PM2.5染毒前清肺抑火膠囊給藥組（清肺抑火膠囊預(yù)防組）：清肺抑火膠囊低、中、高劑量分別連續(xù)灌胃給藥一周（每日一次）后，給予PM2.5氣管滴注染毒（隔天一次，共3次）；

（2）PM2.5染毒后清肺抑火膠囊給藥組（清肺抑火膠囊治療組）：PM2.5氣管滴注染毒（隔天一次，共3次）后，清肺抑火膠囊低、中、高劑量連續(xù)灌胃給藥1周（每日一次）；

（3）給藥對(duì)照組：清肺抑火膠囊高劑量連續(xù)灌胃給藥1周后（每日一次），正常飼養(yǎng)一周；

（4）空白對(duì)照組：正常飼養(yǎng)2周，連續(xù)灌胃給予2mL濃度為0.2%的羧甲基纖維素溶液一周（每日一次）；

（5）PM2.5染毒對(duì)照組1：動(dòng)物正常飼養(yǎng)一周（不給予藥物）后，再進(jìn)行PM2.5染毒（隔天一次，共3次）；

（6）PM2.5染毒對(duì)照組2：動(dòng)物先給予PM2.5氣管滴注染毒（隔天一次，共3次），再正常飼養(yǎng)一周。

(7) 生理鹽水對(duì)照組：動(dòng)物先給予動(dòng)物先給予生理鹽水氣管滴注染毒（隔天一次，共3次），再正常飼養(yǎng)一周。

1.3.2 肺臟支氣管肺泡灌洗

每組取6只大鼠，用10%的水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈抽血處死。結(jié)扎一側(cè)肺的支氣管，該側(cè)肺用于肺病理檢查取樣，另一側(cè)肺做肺灌洗。每次用37℃預(yù)溫的生理鹽水3ml灌洗另一側(cè)肺葉，共灌洗3-4次，收集BALF至8ml，3000r/min離心20min，留取上清液，分裝后于-80℃冰箱保存。細(xì)胞沉淀制成細(xì)胞懸液,做灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。

1.4 肺泡灌洗液中生化指標(biāo)的測(cè)定

采用相應(yīng)的試劑盒測(cè)定肺泡灌洗液中的ACP、AKP、LDH、ALB和TP，ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和Hs-CRP水平。嚴(yán)格按照試劑盒說明書的程序進(jìn)行測(cè)定。包括：酸性磷酸酶（ACP）的測(cè)定（4-氨基安替吡啉法）、堿性磷酸酶（AKP）的測(cè)定（4-氨基安替吡啉法）、乳酸脫氫酶（LDH）的測(cè)定（2，4-二硝基苯肼比色法）、總蛋白（TP）的測(cè)定（考馬斯亮藍(lán)法）、白蛋白（ALB）的測(cè)定（溴甲酚綠法）和白介素-6（IL-6）的測(cè)定（ELISA法）。

應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定肺泡灌洗液中的白細(xì)胞介素-6（IL-6）水平。用純化的白細(xì)胞介素-6（IL-6）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入白細(xì)胞介素-6（IL-6），再與HRP標(biāo)記的IL-6抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的白細(xì)胞介素-6（IL-6）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中白細(xì)胞介素-6（IL-6）含量。

1.4.7 腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-1β、Hs-CRP的測(cè)定（ELISA法）

1.3.3 肺病理切片

取每只大鼠未灌洗一側(cè)肺臟，置10%福爾馬林固定液固定，制成石蠟切片，厚度為5um，用HE（蘇木素-伊紅）染色。光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理改變。

1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以表示，采用SPSS22.0軟件包進(jìn)行ANOVA方差分析。對(duì)各組數(shù)據(jù)分別進(jìn)行各指標(biāo)的方差分析，方差分析結(jié)果提示存在顯著性差異后，再采用多重比較進(jìn)行兩兩比較，多重比較采用LSD法，取P<0.05作為差異顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 肺臟的病理學(xué)觀察

2.1.1大鼠肺臟外觀

空白對(duì)照組大鼠肺組織呈粉紅色，表面有光澤質(zhì)地柔軟；PM2.5染毒對(duì)照組1和染毒對(duì)照組2的肺組織彈性變差，質(zhì)地變硬，肺臟呈灰粉色，可見黑色顆粒物灶狀沉積。清肺抑火膠囊預(yù)防組和治療組的各劑量組肺組織外觀表現(xiàn)較PM2.5染毒對(duì)照組1和染毒對(duì)照組2的有一定程度的改善。

2.1.2 光學(xué)顯微鏡鏡下

空白對(duì)照組（圖1A）、生理鹽水對(duì)照組（圖1B）肺組織切片僅見部分肺泡間隔增厚，肺泡腔內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見顆粒物聚積。PM2.5染毒對(duì)照組1 （圖1C）和染毒對(duì)照組2 （圖1G）的肺內(nèi)，可見PM2.5顆粒聚積，多位于塵細(xì)胞和多核巨細(xì)胞內(nèi)，呈圓形或橢圓形。肺泡間隔增厚及纖維增生，肺泡腔縮小，肺間質(zhì)和肺泡腔內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

藥物預(yù)防低（圖1D）、中（圖1E）、高劑量組（圖1F）中，藥物預(yù)防低、中、高劑量組中，均可見少量顆粒物聚積，肺泡間隔稍微增厚，肺泡腔略縮小，肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其中高劑量組損傷癥狀最輕。各劑量組大鼠肺部損傷情況雖然不同，但均較PM2.5染毒對(duì)照組1損傷情況減輕。

藥物治療低（圖1H）、中（圖1I）、高劑量組（圖1J）中，均可見少量顆粒物聚積，肺泡間隔稍微增厚，肺泡腔略縮小，肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。大鼠肺部損傷情況不同，但均較治療作用的PM2.5染毒對(duì)照組2損傷情況減輕。

圖1 HE染色各大鼠肺病理觀察

注:A:空白對(duì)照：B:生理鹽水對(duì)照：C: PM2.5染毒對(duì)照組1：D:染毒前低劑量給藥：E:染毒前中劑量給藥：F:染毒前高劑量給藥：G: PM2.5染毒對(duì)照組2：H:染毒后低劑量給藥：I:染毒后中劑量給藥：J:染毒后高劑量給藥

2.2肺泡灌洗液中分類細(xì)胞計(jì)數(shù)

如表1所示，與空白對(duì)照組比較，給藥對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組大鼠肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞百分比無顯著性差異（p>0.05）。與空白對(duì)照組相比，PM2.5染毒對(duì)照組1 和染毒對(duì)照組2的大鼠中性粒細(xì)胞百分比均顯著升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

染毒前給藥各劑量組中，隨著清肺抑火膠囊藥物濃度升高，各組的中性粒細(xì)胞百分比降低，呈一定劑量－反應(yīng)關(guān)系，且各劑量組與PM2.5染毒對(duì)照組1相比， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。染毒后給藥組中，隨著藥物濃度升高，各組的中性粒細(xì)胞百分比降低，呈一定劑量－反應(yīng)關(guān)系，各劑量組與PM2.5染毒對(duì)照組2相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組之間的淋巴細(xì)胞百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。

[注] 1=染毒前低劑量給藥組，2=染毒前中劑量給藥組，3=染毒前高劑量給藥組，4=染毒后低劑量給藥組，5=染毒后中劑量給藥組，6＝染毒后高劑量給藥組，7= PM2.5染毒對(duì)照組1，8= PM2.5染毒對(duì)照組2，9=空白對(duì)照組，10=給藥對(duì)照組，11=生理鹽水對(duì)照組。

表1 各組大鼠肺灌洗液中的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞百分比（n=6, ）

注：* ：染毒前給藥組（低、中、高劑量）與PM2.5染毒對(duì)照組1比較P<0.05，＃：染毒后給藥組（低、中、高劑量）與PM2.5染毒對(duì)照組2比較，P<0.05，△：與生理鹽水對(duì)照組進(jìn)行比較，P<0.05。

2.3肺損傷指標(biāo)

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)ACP、AKP 、LDH和肺重比等指標(biāo)的測(cè)定，觀察了解各組動(dòng)物的肺損傷情況。如表2所示，給藥對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組分別與空白對(duì)照組之間比較結(jié)果顯示，肺泡灌洗液中的ACP、AKP、LDH活力和肺重比均無顯著性差異（p>0.05）。與空白對(duì)照組相比，PM2.5染毒對(duì)照組1 和染毒對(duì)照組2大鼠肺泡灌洗液中ACP、AKP、LDH活力和肺重比均升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

染毒前各給藥組（預(yù)防組），隨著藥物劑量增高，各組ACP、AKP、LDH活力和肺重比均呈不同程度的降低，有一定劑量-反應(yīng)關(guān)系，且染毒前各劑量給藥組中AKP活力和肺重比與PM2.5染毒對(duì)照組1比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），染毒前中、高劑量給藥組的ACP和LDH活力與染毒前給藥的PM2.5對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

染毒后各給藥組（治療組）隨著藥物劑量增高，各組的ACP、AKP、LDH活力和肺重比均呈現(xiàn)不同程度降低，有一定劑量-反應(yīng)關(guān)系，且各治療劑量組AKP、LDH活力和肺重比與PM2.5染毒對(duì)照組2 比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,染毒后中、高劑量給藥組的ACP活力與PM2.5染毒對(duì)照組2比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中ACP、AKP、LDH活力和肺重比（n=6, ）

注：* ：藥物預(yù)防組（低、中、高劑量）與PM2.5染毒對(duì)照組1比較P<0.05，＃：藥物治療組（低、中、高劑量）與PM2.5染毒對(duì)照組2比較，P<0.05，△：與生理鹽水對(duì)照組進(jìn)行比較，P<0.05。

[注] 1=染毒前低劑量給藥組，2=染毒前中劑量給藥組，3=染毒前高劑量給藥組，4=染毒后低劑量給藥組，5=染毒后中劑量給藥組，6＝染毒后高劑量給藥組，7= PM2.5染毒對(duì)照組1，8= PM2.5染毒對(duì)照組2，9=空白對(duì)照組，10=給藥對(duì)照組，11=生理鹽水對(duì)照組。

[注] 1=染毒前低劑量給藥組，2=染毒前中劑量給藥組，3=染毒前高劑量給藥組，4=染毒后低劑量給藥組，5=染毒后中劑量給藥組，6＝染毒后高劑量給藥組，7=PM2.5染毒對(duì)照組1，8= PM2.5染毒對(duì)照組2，9=空白對(duì)照組，10=給藥對(duì)照組，11=生理鹽水對(duì)照組。

[注] 1=染毒前低劑量給藥組，2=染毒前中劑量給藥組，3=染毒前高劑量給藥組，4=染毒后低劑量給藥組，5=染毒后中劑量給藥組，6＝染毒后高劑量給藥組，7=PM2.5染毒對(duì)照組1，8= PM2.5染毒對(duì)照組2，9=空白對(duì)照組，10=給藥對(duì)照組，11=生理鹽水對(duì)照組。

[注] 1=染毒前低劑量給藥組，2=染毒前中劑量給藥組，3=染毒前高劑量給藥組，4=染毒后低劑量給藥組，5=染毒后中劑量給藥組，6＝染毒后高劑量給藥組，7=PM2.5染毒對(duì)照組1，8= PM2.5染毒對(duì)照組2，9=空白對(duì)照組，10=給藥對(duì)照組，11=生理鹽水對(duì)照組。

2.4 炎癥細(xì)胞因子指標(biāo)

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)IL-6, IL-1β、TNF-α和Hs-CRP因子的測(cè)試，觀察各組動(dòng)物的機(jī)體炎性損傷情況。如表3所示，給藥對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組分別與空白對(duì)照組之間比較，肺泡灌洗液中的IL-6、IL-1β、TNF-α和Hs-CRP濃度均無顯著性差異（p>0.05）。與空白對(duì)照組相比較，PM2.5染毒對(duì)照組1和PM2.5染毒對(duì)照組2大鼠肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β、TNF-α和Hs-CRP濃度均升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

染毒前各劑量給藥組，隨著藥物劑量增高，各組均不同程度的表現(xiàn)出IL-6、IL-1β、TNF-α和Hs-CRP濃度降低，有一定劑量-反應(yīng)關(guān)系。且低、中、高劑量給藥組的IL-1β、TNF-α、Hs-CRP濃度和中、高劑量給藥組的IL-6與PM2.5染毒對(duì)照組1比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

染毒后各劑量給藥組，隨著藥物劑量增高，各組均不同程度的表現(xiàn)出IL-6、IL-1β、TNF-α和Hs-CRP濃度降低，有一定劑量-反應(yīng)關(guān)系，且染毒后低、中、高劑量給藥組的IL-1β、Hs-CRP濃度和中、高劑量組的IL-6、TNF-α與PM2.5染毒對(duì)照組2比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

[注] 1=染毒前低劑量給藥組，2=染毒前中劑量給藥組，3=染毒前高劑量給藥組，4=染毒后低劑量給藥組，5=染毒后中劑量給藥組，6＝染毒后高劑量給藥組，7= PM2.5染毒對(duì)照組1，8= PM2.5染毒對(duì)照組2，9=空白對(duì)照組，10=給藥對(duì)照組，11=生理鹽水對(duì)照組。

[注] 1=染毒前低劑量給藥組，2=染毒前中劑量給藥組，3=染毒前高劑量給藥組，4=染毒后低劑量給藥組，5=染毒后中劑量給藥組，6＝染毒后高劑量給藥組，7= PM2.5染毒對(duì)照組1，8= PM2.5染毒對(duì)照組2，9=空白對(duì)照組，10=給藥對(duì)照組，11=生理鹽水對(duì)照組。

[注] 1=染毒前低劑量給藥組，2=染毒前中劑量給藥組，3=染毒前高劑量給藥組，4=染毒后低劑量給藥組，5=染毒后中劑量給藥組，6＝染毒后高劑量給藥組，7= PM2.5染毒對(duì)照組1，8= PM2.5染毒對(duì)照組2，9=空白對(duì)照組，10=給藥對(duì)照組，11=生理鹽水對(duì)照組。

[注] 1=染毒前低劑量給藥組，2=染毒前中劑量給藥組，3=染毒前高劑量給藥組，4=染毒后低劑量給藥組，5=染毒后中劑量給藥組，6＝染毒后高劑量給藥組，7= PM2.5染毒對(duì)照組1，8= PM2.5染毒對(duì)照組2，9=空白對(duì)照組，10=給藥對(duì)照組，11=生理鹽水對(duì)照組。

表3 各組大鼠肺泡灌洗液中IL-6,IL-1β,TNF-α和CRP濃度（n=6, ）

注：* ：藥物預(yù)防組（低、中、高劑量）與PM2.5染毒對(duì)照組1比較P<0.05，＃：藥物治療組（低、中、高劑量）與PM2.5染毒對(duì)照組2比較，P<0.05，△：與空白對(duì)照組進(jìn)行比較，P<0.05。

2.5肺泡上皮-毛細(xì)血管屏障損傷指標(biāo)

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)TP、ALB等指標(biāo)的測(cè)定，觀察各組動(dòng)物的肺泡上皮-毛細(xì)血管屏障損傷的情況。如表4所示，給藥對(duì)照組、生理鹽水對(duì)照組分別與空白對(duì)照組之間比較，肺泡灌洗液中的TP、ALB含量均無顯著性差異（p>0.05）。與空白對(duì)照組相比較，PM2.5染毒對(duì)照組1和PM2.5染毒對(duì)照組2肺泡灌洗液中TP、ALB含量均升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

染毒前給藥組隨著藥物劑量增高，各實(shí)驗(yàn)組均不同程度的表現(xiàn)出TP、ALB含量降低，有一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系，且染毒前低、中、高劑量給藥組的ALB含量和中、高劑量給藥組的TP含量與PM2.5染毒對(duì)照組1比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

染毒后給藥組隨著藥物劑量增高，各組均不同程度的表現(xiàn)出TP、ALB含量降低，并有一定劑量-反應(yīng)關(guān)系，且染毒后低、中、高劑量給藥組TP含量和中、高劑量給藥組的ALB含量與PM2.5染毒對(duì)照組2比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

[注] 1=染毒前低劑量給藥組，2=染毒前中劑量給藥組，3=染毒前高劑量給藥組，4=染毒后低劑量給藥組，5=染毒后中劑量給藥組，6＝染毒后高劑量給藥組，7= PM2.5染毒對(duì)照組1，8= PM2.5染毒對(duì)照組2，9=空白對(duì)照組，10=給藥對(duì)照組，11=生理鹽水對(duì)照組。

[注] 1=染毒前低劑量給藥組，2=染毒前中劑量給藥組，3=染毒前高劑量給藥組，4=染毒后低劑量給藥組，5=染毒后中劑量給藥組，6＝染毒后高劑量給藥組，7= PM2.5染毒對(duì)照組1，8= PM2.5染毒對(duì)照組2，9=空白對(duì)照組，10=給藥對(duì)照組。

表4 各組大鼠肺泡灌洗液中ALB和TP（n=5, ）

注：* ：藥物預(yù)防組（低、中、高劑量）與的PM2.5染毒對(duì)照組1比較P<0.05，＃：藥物治療組（低、中、高劑量）與PM2.5染毒對(duì)照組2比較，P<0.05，△：與生理鹽水對(duì)照組進(jìn)行比較，P<0.05。

3 討論

近年來，人們對(duì)PM2.5的健康危害越來越重視，對(duì)PM2.5致機(jī)體損傷的機(jī)制研究越來越深入，與此同時(shí)，也在試圖尋找合理、有效的抗損傷物質(zhì)，藥物干預(yù)PM2.5致機(jī)體損傷的研究較少見。氣管滴注染毒是一種方便有效且易于控制劑量的染毒方法。本實(shí)驗(yàn)通過氣管滴注的方法建立PM2.5染毒模型，用不同劑量清肺抑火膠囊分別在PM2.5染毒前后給藥干預(yù)PM2.5 引起的肺損傷。采用對(duì)肺泡灌洗液成分的分析，評(píng)價(jià)清肺抑火膠囊給藥對(duì)PM2.5染毒致肺損傷及炎癥反應(yīng)的藥效作用及其可能機(jī)制。

相關(guān)研究中，通過氣管滴注染毒研究PM2.5對(duì)大鼠或小鼠肺急性損傷對(duì)實(shí)驗(yàn)研究，病理組織觀察結(jié)果表明，各劑量組與對(duì)照組有明顯的炎癥性病變，主要表現(xiàn)在單核細(xì)胞浸潤(rùn)和淋巴細(xì)胞增生，有黏膜損傷和血管出血，并隨著劑量增加，病變有加重的趨勢(shì)[11]。 病理結(jié)果顯示PM2.5對(duì)照組能觀察到明顯的肺體比增加、肺泡間隔增和肺泡腔炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。PM2.5染毒前給藥和染毒后給藥各劑量組肺體比增加和病理學(xué)改變較PM2.5對(duì)照組輕，且隨著藥物濃度升高，肺組織損傷呈一定梯度減輕，即藥低劑量給藥組損傷程度較輕，中劑量給藥組次之，高劑量給藥組損傷癥狀最輕。提示清肺抑火膠囊干預(yù)具有減輕PM2.5對(duì)肺組織的損傷作用。

呼吸道是大氣PM2.5污染直接作用的靶器官，大氣PM2.5會(huì)引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸道中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、淋巴細(xì)胞及肥大細(xì)胞聚集等較為明顯的炎癥反應(yīng)，并可在宿主效應(yīng)細(xì)胞如肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞檢測(cè)到相關(guān)細(xì)胞因子mRNA水平的增高[12]。目前認(rèn)為與顆粒物引起呼吸道炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子有IL-1、IL-6、IL-8、INF、TNF-α[13]。嚴(yán)重而持久的炎癥反應(yīng)會(huì)增加肺組織的防御屏障負(fù)擔(dān)，引起組織增生纖維化，導(dǎo)致慢性阻塞性肺疾患。

肺灌洗液的生化成分包括肺表面活性物質(zhì)，從細(xì)胞分泌的各種酶和抗體成分，以及從血管中滲出的各種分子物質(zhì)等。當(dāng)肺細(xì)胞受損和細(xì)胞膜通透性改變時(shí)，許多細(xì)胞內(nèi)成分可釋放到細(xì)胞外。對(duì)灌洗液中的各成分分析可反映毒物對(duì)動(dòng)物肺的損傷情況。

有研究表明，顆粒物進(jìn)入肺部以后，可使肺泡腔毛細(xì)血管膜、血管基底膜破壞，肺Ⅰ型、Ⅱ型細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變或壞死，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，一定程度的肺病理損傷，并可使肺細(xì)胞通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物漏出，包括各種蛋白、ACP、AKP、LDH等[14]。ACP是溶酶體酶，在巨噬細(xì)胞中含量較多，參與肺部的防御反應(yīng)，當(dāng)肺巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用而崩解死亡后，大量的ACP就會(huì)進(jìn)入肺泡灌洗液中。AKP主要由肺泡Ⅱ型細(xì)胞產(chǎn)生，其含量提示了肺泡Ⅱ型細(xì)胞受損程度[15]。LDH屬于胞漿酶，來源于血液或肺損傷后組織滲漏到肺泡，是反映細(xì)胞膜損傷的早期敏感指標(biāo)[16]。肺灌洗液中的TP、ALB主要來自血漿滲出，反應(yīng)了肺泡上皮-毛細(xì)血管屏障的損傷程度[17]。TNF-α、IL-6和IL-1β是重要的炎性因子，分別具有促進(jìn)骨髓細(xì)胞的分化、B淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)和激活中性粒細(xì)胞等作用，是機(jī)體早期炎癥反應(yīng)的敏感指標(biāo)[18]。C-反應(yīng)蛋白是急性相反應(yīng)中最重要的蛋白，當(dāng)機(jī)體處于炎癥、感染或創(chuàng)傷狀態(tài)時(shí)，血液中很快出現(xiàn)這種反應(yīng)蛋白，它是反應(yīng)炎癥的一個(gè)敏感指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PM2.5對(duì)照組中的ACP、AKP、LDH活性、TP含量均高于各個(gè)對(duì)照組、染毒前給藥組和染毒后給藥組。表明PM2.5氣管滴注染毒可以通過增加肺細(xì)胞通透性，使細(xì)胞酶滲出增加，以及對(duì)肺泡上皮-毛細(xì)血管毒作用導(dǎo)致肺損傷。清肺抑火膠囊染毒前給藥組和染毒后給藥組中，灌洗液內(nèi)中性粒細(xì)胞百分比、ACP、AKP、LDH活性、TP含量隨肺化痰丸給藥劑量增加，有一定程度下降，表現(xiàn)為劑量－反應(yīng)關(guān)系。提示清肺抑火膠囊無論在PM2.5氣管滴注染毒前給藥還是染毒后給藥，都對(duì)其引起的肺組織損傷有一定改善作用。

灌洗液中細(xì)胞因子 IL-6、IL-1β、TNF-α釋放量、ALB含量以及Hs-CRP含量顯示，PM2.5對(duì)照組高于清肺抑火膠囊染毒前給藥組和染毒后給藥組以及空白對(duì)照組，表明PM2.5染毒可以引起肺組織炎癥。清肺抑火膠囊染毒前給藥組和染毒后給藥組中，這些細(xì)胞炎癥因子和其反應(yīng)蛋白含量有一定程度下降，且隨清肺抑火膠囊劑量增加，各細(xì)胞因子和蛋白含量下降幅度增大，提示清肺抑火膠囊對(duì)PM2.5染毒引起的肺組織炎癥有明顯的減輕作用，也提示清肺抑火膠囊可能通過改變炎性因子的釋放對(duì)PM2.5導(dǎo)致的肺損傷產(chǎn)生一定程度的干預(yù)作用。

效果優(yōu)劣與藥物劑量的大小有關(guān)，在一定藥物劑量范圍內(nèi)，隨著劑量的增加，藥物的預(yù)防和治療效果有一定的上升趨勢(shì)。因此在一定劑量范圍內(nèi)服用清肺抑火膠囊，可以一定程度的減輕PM2.5對(duì)肺部的損傷作用，保護(hù)肺部組織。

4 結(jié)論

綜上研究和分析，清肺抑火膠囊對(duì)氣管滴注染毒PM2.5導(dǎo)致的肺損傷，無論是染毒前給藥還是染毒后給藥，都有一定改善作用。具體表現(xiàn)在肺組織毒作用降低和肺組織炎癥的減輕。因此認(rèn)為，清肺抑火膠囊對(duì)PM2.5導(dǎo)致的肺損傷具有明顯的治療和改善作用。


 


 

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環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室

2015年07月

編輯：雨忱